NGS肿瘤体细胞突变检测
样本类型：组织样本（新鲜组织+⽯蜡切⽚）以及cfDNA样本
可查阅2017年 FDA批准的FoundationOne CDx™和MSK-IMPACT两个组织样本⼤Panel以及2018年CFDA批准的国内⼏个⼩Panel的相关产品说明。另外对于cfDNA⾎浆样本，⽬前除EGFR基因外，尚未有相关产品获批。
接下来从样本类型⼊⼿，对这两种类型样本相关NGS产品的主要注意事项进⾏说明：
⼀. 肿瘤组织样本WGS/WES/靶向 Pa nel测序产品：
Part1----测序前：该产品/公司能否提供以下⼗⼀项内容或说明？在职研究生考试时间2022
（1.1）该产品是否包含肿瘤纯度评估内容：
肿瘤组织是不同亚型的肿瘤细胞和正常细胞的混合物，原始送检样本中肿瘤细胞⽐例直接决定着最终检测结果，尤其是因肿瘤细胞⽐例过低（<10%，MSK-IMPACT）时带来的假阴性结果。所以不管是WES/WGS还是Panel靶向测序，在交付测序分析结果的同时也应提供肿瘤纯度评估结果；
（1.2）该产品是否为Tumor/Normal配对检测：
Tumor only型产品虽然报价低，但⼤部分公司下游⽣信分析⽅法尚不成熟，除了Foundation Medicine的Tumor only分析⽅法获FDA批准认可外，其它相关公司更多是出于控制成本和占领市场⽽⾮检测结果准确性的⾓度考虑。
（1.3）该Panel设计的内含⼦区域及建库测序⽅法 (见图1)：
Panel产品中内含⼦区域的有⽆以及内含⼦位置和数⽬决定了能不能进⾏DNA层⾯的融合基因检测以及融合基因检测结果的可靠性；
建库测序⽅法---扩增⼦建库or杂交捕获建库：基于杂交捕获法得到的NGS测序数据相较于扩增⼦测序数据往往具有较好的均⼀性，有利于下游⽣信分析，尤其是拷贝数变异和融合基因的检测；同时扩增⼦Panel增加或删减个别基因都会影响到全局的引物扩增效率，对于临时增加或减少扩增⼦Panel中基因数⽬的操作需要慎重对待；
（1.4）该产品的测序深度与突变检测下限：
Panel组织样本的测序深度：（质控后clean data）在500X~1000X之间即可，随着测序深度增加，引⼊PCR重复序列的⽐例也随之升⾼，⽆效数据⼤幅增加，对于体细胞突变检测意义不⼤；
突变检测下限：不管是1%，还是5‰，请对⽅同时提供该检测下限的突变reads⽀持数⽬；
（1.5）该产品转产前的验证报告：
根据该产品转产前⽤于验证的标准品基因数⽬、突变位点数⽬，QC，数据覆盖度均⼀性，⼈员操作的精密度以及验证结果的PPV,NPV等情况对该产品性能有基本了解。
（1.6） 该产品检测内容：
⼀个设计良好的组织样本NGS产品可以对点突变（SNV）、插⼊缺失 （insert/deletion）、拷贝数变异（CNV），基因融合，微卫星不稳定（MSI）五部分内容进⾏检测，⽽且每部分都应有对应的检测下限；
此外，对于具有家族病史的肿瘤患者，还应将其体细胞突变和配对的Normal样本中的germline突变结合起来进⾏分析，去年癌症癌症图谱计划发表的两篇⽂章进⼀步显⽰癌症患者中存在germline致病突变的⽐例（~8%）不容忽视：
见 cell1,cell2，进⼀步回应了经典的肿瘤⼆次打击学说，这就是经典学说的魅⼒吧！
(1.7) 该产品变异检测的其它备选⽅法（见图2）：
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⽬前不同主流体细胞突变检测软件的突变检出⼀致率并不⾼，⾮主流突变检测软件更难称得上靠谱，所以重要项⽬同时⽤两套以上分析⽅法进⾏分析还是有必要的。
(1.8) 技术⼈员资质及⽤药数据库建设及更新情况
避免⾃⼰成为----专业背景不对⼝、缺乏相关⼯作经验的后台技术⼈员推出的这个新产品的⼩⽩⿏；湖北省省考公务员报名时间
(1.9) 建库前的捕获测序以及样本特性（FFPE⽯蜡切⽚）等引⼊的假阳性突变
⾼深度的靶向捕获测序探针覆盖的均⼀性、捕获过程中的DNA损伤以及FFPE样本（⽐如2年以上）的处理和储存过程引起的核酸损伤和降解，导致的⽣信分析结果中出现⼤量的GA/CT假阳性突变，以及与测序平台相关的背景噪⾳--⼤量样本中普遍存在的低丰度突变，如何解决？
（1.10）有没有定期的质量验证和纠正措施
基因测序公司的⼈员流动性普遍⽐较⼤，即便以上内容全都做的很到位，还需要有良好的规章制度，⽐如定期的⾃⾏验证报告，以保证不同⼈员批次产品结果的稳定；
（1.11） X10测序平台的同line污染如何应对
⼤部分⼩公司都会把测序业务外包给具有 illumina X10测序平台的⼤公司，但X10平台建库过程中样本预混合时间相对其它测序平台较长，同⼀条line的不同样本在预混合过程中barcode脱落引起的样本间的相互污染( 但不确定后来illumina很快推出的Novoseq平台是否已经解决该问题），如何应对？
图1：不同建库⽅式对肿瘤体细胞突变检测的影响：来源：
江苏公务员招聘网max.book118/html/2017/0703/120032109.shtm
图2：不同体细胞突变分析软件gDNA检出结果⼀致性⽐较：来源：www.nature/articles/srep36540
Part2---测序后：样本质控信息及突变注释数据库版本
（2.1）组织样本测序数据质控信息应包括：
（2.1）组织样本测序数据质控信息应包括
a. 插⼊⽚段长度的均值/中位数；
b. GC⽐例及均⼀性分布图；
c. 样本间交叉污染评估（防⽌错配及其它样本污
染）；d. bam⽂件靶区域覆盖度的均值/中位数；e. 其它Q30等指标
（2.2） ⽤于突变注释的数据库版本
宜兴市教育信息网COSMIC/ClinVar等重要数据库每年都会更新多版，这些数据库直接影响着突变致病性的解读，需要及时更新，另外也需要及时引⼊其它数据库对常规数据库中未收录的⾮同义突变的致病性进⾏预测。
⼆. cfDNA样本Panel产品
Part1----测序前：该cfDNA产品是否能提供以下⼗项检测内容或说明：
2.1. 获得CAP/CFDA认证资格的公司与其产品靠谱的相关性有多⼤？
⼀⽅⾯⽤于CAP/CFDA认证考试的标准品位点的突变频率相对较⾼；另⼀⽅⾯任何⼀家公司都会不计成本地投⼊⼈⼒、物⼒做好标准品以拿到这些证书；最后标准品跟实际样本往往区别很⼤，所以拿到这些证就像考研过了国家线，与其实际科研解决问题的能⼒不存在必然联系；
苏州狮山路人才市场最新招聘信息2.2. 采⾎⽐采组织样本⽅便，直接⽤⾎液样本的NGS结果代替组织样本？
发⽂章可以，做biomarker筛选最好不要这样⼲，2018年的相关⽂献报道的cfDNA和组织样本体TMB/b
TMB的⼀致性也仅在0.64左右，其突变位点检出的⼀致性更低，建议有组织样本就尽量⽤组织样本。2017年对国外主流ctDNA 公司检测结果的⽐较的研究报道以及2018年ASCO发布的ctDNA相关的临床建议，都显⽰当前业内对肿瘤ctDNA的临床应⽤价值还存在不少争议。
2.3. 样本融⾎影响⼤不⼤？
轻度溶⾎需标记备注，中度以及重度融⾎影响检测结果，须重新送样，此外⾎样处理时间，采样管材质等众多因素都会影响到ctDNA的检测结果。
2.4. 是否需要⾎浆/⽩细胞配对检测？
当前那些声称可以对cfDNA⾎浆样本进⾏⾮配对检测的都是耍流氓；
2.5. cfDNA样本的WGS/WES产品是否靠谱？
某些癌种在科研上有对cfDNA进⾏WGS/WES测序分析的例⼦，但实际⽣产中必然存在较⼤范围漏点（捕获不到，测不到）的情形；
2.6. cfDNA/组织样本体细胞突变检测是否同时应设置检测上限 [见图3]？
由于肿瘤组织的异质性，携带特定体细胞突变的肿瘤细胞在组织中的占⽐介于0%-100%之间，因此不管是cfDNA 还是组织样本，从保证结果特异性的⾓度出发对体细胞突变设置检测下限是有必要的，但是设置检测上限是没有根据的，其背后可能反映着⽣信分析流程的bug以及后台技术⼈员的不专业;
2.7. cfDNA Panel建库测序的UMI分⼦标签及测序深度
cfDNA必须加UMI建库测序（组织则样本没必要），以减少低频突变假阳性位点的⼲扰，另外UMI深度及⽀持数⽬应体现在下游质控分析和变异检测结果中；
根据2016年的⽂献及业内主流公司产品，cfDNA样本测序深度应在20,000X以上；
2.8. 请对⽅同时提供cfDNA产品转产前验证报告及ctDNA与组织样本突变检测⼀致性报告
GIAB官⽹提供的标准品中的已知位点毕竟有限，有⼀定样本积累公司会对ctDNA与组织样本突变检出⼀致率进⾏⽐较，从整体层⾯对⾃⼰cfDNA产品做⼀个评估；
2.9. 请对⽅提供⽩细胞克隆造⾎等特殊情况的解决⽅案
约5%~10%的⽼年⼈会发⽣克隆性造⾎---⾎液中存在低丰度的克隆性造⾎相关基因突变，这些突变往往难以与肿瘤特有突变进⾏区分；
2.10. 请对⽅提供检测内容及各项检测内容的检测下限
⽬前⽆法从cfDNA层⾯检测微卫星不稳定（MSI），在拷贝数变异（CNV）检测⽅⾯也⽆法通过评估cfDNA中ctDNA⽐例来估计肿瘤细胞占⽐；其它基因融合及insert/deletion检测也往往没有组织样本准确；
图3：肿瘤组织异质性：来源：⽹络
Part2: 测序后：数据质控及突变检测结果IGV验证
数据质控
数据质控：除reads测序深度外，必须同时提供UMI深度信息，其它质控条件同组织样本；
验证：cfDNA突变检测难度较⼤，结果容易出现假阳性突变，因此对于最终检测结果的可靠性，需同突变检测结果IGV验证
时索要⽤于变异检测的bam及索引⽂件，在windows本地安装的IGV基因组浏览器上对SNV/INDEL以及融合基因进⾏验证，最后突变注释相关注意事项同组织样本。
三. 实际项⽬中的⼀些常见疑问
Q1: 同⼀个病⼈不同时间点上的体细胞突变检测，配对Normal样本是否需要多次采样测序？
对于具备较好技术积累和运营透明度的测序公司，Normal样本的germline突变在不同批次建库测序分析中不会有⼤的起伏，配对Normal样本只测⼀次即可；
Q2：同⼀个病⼈在不同时间点上cfDNA样本的体细胞突变检测结果⽆交集？
同⼀个cfDNA样本不同⽂库的测序分析结果是会存在差异，但是如果⼊组的多个个体都在不同时间点上的体细胞突变都没有交集，则需考虑质控以及该产品是否存在bug，可换⼀家公司对原始数据重新分析；
Q3： 结题报告中的结果与实验设计及预想结果出⼊较⼤：
不⽤急着否定⾃⼰的实验设计，先把原始数据换⼀家公司重新分析⼀遍，着重⽐较数据质控和突变检测两部分内容；
Q4：Panel⼤⼩与TMB及突变检出数⽬的相关性？（见图4）
如图4所⽰：外显⼦总长度在1Mb以上（基因数⽬约300个以上）的Panel，其TMB值与WES数据有较好的⼀致率。同时⼤Panel在肿瘤纯度、染⾊体倍性评估以及相关的拷贝数变异分析上也会有较准确的结果；
Q5: 关于合同上经常出现的数据量及测序深度：
⼀味吹嘘测序数据量⼤、测序深度⾼的的产品往往⽔分⽐较⼤--这是实在拿不出其它硬性技术指标的节奏；另外对于测序深度，最好分清楚是raw data、clean data、重后的bam⽂件还是UMI深度这四个中的哪⼀个；
Q6: 肿瘤驱动突变、免疫组库技术、肿瘤疫苗、ctDNA甲基化早筛等前沿技术产品？
及时跟进，暂不做评价
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