DOI：10.16174/j.issn.1673-4645.2023.03.018
收稿日期：2023-05-16
基金项目：贵州省科技支撑计划项目（黔科合支撑[2021]一般147）；贵州省生猪产业发展项目（黔财农[2021]157号、黔财农[2022]183号）；贵州省种业发展项目（黔农计财[2022]10号）；国家重点研发计划子课题项目（2022YFD1100308-01）作者简介：郭小江（1981-），男，贵州贵阳人，高级兽医师，主要研究方向为动物疫病防控
*
通信作者：张依裕（1976-），男，贵州黔西人，博士，教授，主要研究方向为动物遗传与育种
柯乐猪TAC3第1内含子多态对繁殖性状的影响
郭小江1
熊力2
谭元成3
杨红文4
杨齐心4
贵州163人才信息招聘网事业单位杨酸3
向
进3张依裕3*
(1贵州省草地技术试验推广站，贵州贵阳550000;2
贵州省动物疫病预防控制中心，贵州贵阳550000;3
贵州大学动物
科学学院高原山地动物遗传育种与繁殖教育部重点实验室，贵州贵阳550025;4
贵州省畜禽遗传资源管理站，贵州贵阳
550000)
摘要:TAC3基因参与哺乳动物繁殖相关的生命活动。试验以78头初产柯乐猪为材料，通过PCR 产物直接测序和序列比对鉴定TAC3基因的遗传变异，分析遗传变异对繁殖性状的影响。结果显示，在柯乐猪TAC3基因第1内含子中检测到1个中度多态位点:g.22329038T>C ，产生3种基因型TT 、TC 和CC ,TC
和T 分别为优势基因型和优势等位基因，基因型分布未偏离Hardy-Weinberg 平衡,TT 基因型个体的产活仔数显著高于CC 基因型(<0.05)，其他指标在不同基因型间差异未能达到显著水平(>0.05)，揭示g.22329038T>C 位点可能是柯乐猪产活仔数的一个重要分子标记。关键词：柯乐猪;TAC3基因；多态性；繁殖性状中图分类号:S828
文献标识码:A
文章编号:1673-4645(2023)03-0090-04
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Effects of TAC3Intron 1Polymorphism on Reproductive Traits in Kele Pigs
GUO Xiaojiang 1,XIONG Li 2,TAN Yuancheng 2,YANG Hongwen 4,YANG Qixin 4,YANG Suan 2,XIANG Jin 2,ZHANG Yiyu 2*
（1Grassland Technology Experiment Extension Station of Guizhou Province,Guiyang 550000,China；2Center for Animal Disease Control
and Prevention of Guizhou Province,Guiyang 550000,China;3Key Laboratory of Genetic Breeding and
Reproduction of Plateau Moun-tain Animals,Ministry of Education,College of Animal Science,Guizhou University,Guiyang 550025,China;4Livestock and poultry Ge-netic Resources Management Station of Guizhou Province,Guiyang 550000,China)
Abstract:TAC 3gene was involved in life activities related to mammalian reproduction.Direct sequencing of PCR products and se-quence alignment were implemented to identify the SNP of TAC3gene intron 1in 78Kele pigs and analyzed the influence of SNP locus on reproductive traits.The results showed that a moderately polymorphic site of
g.22329038T＞C was detected in intron 1of the TAC3
繁殖力的高低决定了养猪生产效率和经济回报。因此，母猪的繁殖力一直都是育种学家和养殖业主最为重视的目标性状。但由于繁殖力是一个低遗传力性状，受环境影响较大，通过常规的手段难以提升其繁殖指标，将分子育种手段应用于猪的繁殖性状选择是提高繁殖的重要手段[1]。现有的研究结果显示，促性腺激素释放激素（GnRH）和下丘脑激活的分泌对垂体和卵巢功能的发挥起至关重要的作用，下丘脑障碍可能引起卵巢静止，下丘脑－垂体－卵巢轴协调调控性器官的发育和配子的形成，下丘脑、垂体、卵巢中基因的表达水平呈时序性变化，进而影响卵泡发育、卵泡成熟及其排卵等生殖活动[2,3]。速激肽3（TAC3）基因编码速激肽家族中的神经激肽B（NKB），在下丘脑弓状核高表达，分沁NKB的神经元
主要位于下丘脑漏斗区域和下丘脑前部，同时，在外周组织如胎盘、卵巢等中表达也相当丰富。母猪初情期的启动取决于NKB通过与神经激肽B受体3（NK3R）结合诱导GnRH释放[4,5]。Topaloglu等[6]报道，突变TAC3或其受体TACR3基因的突变会引起GnRH 分泌减少，导致人促性腺激素综合征发生。García-Or-tega等[7]研究发现，NKB/NK3R系统在人颗粒细胞及卵母细胞中的表达水平随细胞分化程度而发生变化，直接调节卵巢颗粒细胞的功能。因此，TAC3基因可能参与哺乳动物繁殖相关的生命活动如初情期启动、卵巢卵泡的成熟等。柯乐猪繁殖力低，提高其繁殖力是当前的主要育种工作。本研究通过鉴定柯乐猪TAC3基因的多态性，并分析其多态性对繁殖指标的影响，探索其作为繁殖性状选择的分子标记的可行性，以推进柯乐猪的育种工作。
1材料与方法
1.1试验动物
健康状态良好的初产柯乐猪母猪78头，来源于贵州优农谷发展有限公司。1.2样品采集和数据收集
清洁消毒的耳号钳采集柯乐猪的耳组织，每头采集后，火烧冷却后采集第2头，重复操作，保障每头样品不产生混样，采集后的样品于-80℃冰箱保存。测定每头柯乐猪的5个繁殖指标，包括总产仔数、产活仔数、仔猪初生个体重、断奶仔猪数和断奶个体重。
1.3基因组DNA提取
根据组织的基因组DNA提取试剂盒的操作说明，分别提取柯乐猪母猪每个个体的基因组DNA，1%琼脂糖凝胶电泳和核酸检测仪检测DNA完整性和浓度，对DNA浓度进行稀释，终浓度为150ng/μL。
1.4引物设计与PCR扩增
根据GenBank收录的TAC3基因（NC_010447.5）序列，Oligo6.0设计1对引物扩增其第1内含子，正向引物：5’-GGGATTGGTGATTCTCAGTC-3’，反向引物：5’-CACATATTTCCCCAGGATGT-3’，扩增区域：g.22328450-22329041，包含第1外显子和部分内含子，PCR扩增体系：2×Taq PCR Master Mix10μL，DNA模板1.5μL，上下游引物各1.5μl，RNase-Free Water10.5μL，共25μL体系。PCR反应程序：95℃预变性12min；95℃变性60s，58℃退火60s，72℃延伸80s，共30个循环；72℃延伸8min。1.2%琼脂糖凝胶电泳和凝胶成像系统检测PCR产物并拍照，PCR 产物送北京康为世纪生物技术有限公司进行测序。
1.5统计分析
利用DNA Star软件中Editseq和MegAlign程序及人工校对鉴定SNP位点，Haploview软件计算SNP位点的基因型和等位基因频率以及多态信息含量（PIC），卡方计算器对基因型分布卡方值（χ2）进行计算，SPSS
gene of Kele pig.TT,TC and CC were generated.TC and T were dominant genotypes and dominant alleles,respectively.The distribu-tion of genotypes did not deviate from Hardy-Weinberg equilibrium.The number of live births of TT genotype individual was significantly higher than that of CC genotype(＜0.05).The other indexes were not significantly different among different genotypes(＞0.05)。The results suggested that the g.22329038T＞C site may be an important molecular marker for the number of live births in Kele pigs.
Key words:Kele pig;TAC3gene;polymorphism;reproductive traits
图1TAC3基因SNP 鉴定(A:PCR 扩增产物;B:SNP 鉴定峰图)
18.0软件分析SNP 位点基因型与繁殖指标效应程度。
2结果与分析
2.1TAC3基因SNP 鉴定
采用1.2%琼脂糖凝胶电泳检测引物的PCR 产物，表明扩增产物条带清晰，无杂带（图1A ）。对PCR
产物的测序结果进行序列比对，在柯乐猪TAC3基因第1内含子中检测到1个SNP 位点：g.22329038T＞C ，产生3种基因型，分别为TT、TC 和CC。
2.2TAC3基因g.22329038T>C 位点的遗传特性分析
通过分析TAC3基因中g.22329038T＞C 位点在柯乐猪体中的遗传参数（见表1）。结果表明，TC 基因型是优势基因型，其频率为0.436；T 是优势等位基因，其频率为0.577；多态信息含量（PIC ）为0.369，PIC 处于0.25～0.50之间，其为中度多态位点，基因型χ2值为1.433，基因型分布未偏离Hardy-Weinberg 平衡（＞0.05）。
2.3TAC3基因g.22329038T>C 位点对柯乐猪繁殖性状的影响
由表2可知，g.22329038T＞C 位点TT 基因型个体在产活仔数上显著高于CC 基因型（＜0.05），g.22329038T＞C 位点的不同基因型对总产仔数、初生
个体重、断奶仔猪数和断奶个体重的影响均没有达到显著的水平（＞0.05）。
3讨论
现有的研究证实，TAC3基因在猪下丘脑弓状核高表达，其编码的蛋白质NKB 是一种神经肽，对哺乳动物的生殖系统发育与成熟有重要调控作用。孙晓笛[8]研究表明，TAC3基因在小尾寒羊卵巢和子宫体中的表达量与常年发情有关。Garc ía-Ortega 等[7]报道了TAC3基因编码的蛋白质NKB 和KISS1基因编码的蛋白Kisspeptin 在直接作用于人卵巢卵泡颗粒细胞，促进卵泡成熟。蒋书东等[9]报道，母犬下丘脑、
垂体和卵巢中TAC3mRNA 表达量表现为从仔犬期至初情期逐渐上升，初情期达最高，揭示NKB 可能参与母犬初情期的启动。
花雯[10]发现皖西白鹅就巢期和休产期各级卵泡颗粒层细胞、卵泡膜及间质部位NKB 表达量显著低于产蛋期。邢燕[11]研究表明母猪初情期启动时下丘脑、垂体和卵巢
表3不同剂量的益生菌制剂对仔猪血清免疫指标的影响表1TAC3基因g.22329038T>C 位点的体遗传参数
位点 基因型频率（样本数）
等位基因型率
PIC 2 TT （28） TC （34） CC （16） T C g.22329038 T ＞C
0.359
0.436
0.205
0.577
0.423
0.369
1.433
注：PIC-多态信息含量，χ20.05（2）＝5.991，χ20.01（2）＝9.21。
表3不同剂量的益生菌制剂对仔猪血清免疫指标的影响表2TAC3基因g.22329038T>C 位点与繁殖性状的相关性
SNPs
基因型 总产仔数/头 产活仔数/头 初生个体重/kg 断奶仔猪数/头 断奶个体重/kg TT
9.098±0.410 8.415±0.247a 1.044±0.035 7.561±0.422 5.709±0.152 TC 8.978±0.194 8.317±0.214ab 1.071±0.017 7.137±0.209 5.677±0.106 g.22329038 T ＞C
CC
8.550±0.363
7.500±0.133a
1.050±0.035
6.475±0.394
5.780±0.154
注：同列数据肩标字母不同表示差异显著（＜0.05），肩标字母相同或无字母表示差异不显著（P ＞0.05）。
中TAC3mRNA水平表达上调，到初情期后表达量逐渐减少。Wang等[12]报道了TAC3与香猪的繁殖性状相关。另外，KISS1编码的蛋白质Kisspeptin与TAC3编码的蛋白质NKB协同调控下丘脑GnRH的释放，进而促进卵巢LH分泌[13]。
至今，已有研究表明TAC3基因的变异能影响人和哺乳动物的繁殖性能。Xin等[14]对人的研究发现中国女孩TAC3基因中存在9个SNP位点，其中A63P突变与特发性性早熟相关。Tusset等[15]研究也表明A63P突变与特发性中枢性青春期障碍有关。但是关于猪TAC3基因的遗传变异对繁殖性状的影响至今罕见报道。本研究在柯乐猪TAC3第1内含子中发现了g.22329038T＞C突变，且该突变对产活仔数的影响达显著水平（＜0.05），TT基因型为有利基因型。在真核生物中的基因组中，基因多处于断裂状态，各外显子之间由内含子所隔离，在转录过程中，内含子会被剪切掉，但内含子突变会调控转录而影响转录的效率已被大量的试验所证实，甚至于内含子的突变可导致剪接失效，产生不同的基因剪接体并导致生产性能的改变[16]。多态信息含量（PIC）是决定育种进展的一个重要指标，低的PIC制约选择，反之则有利于选择[17]。本研究结果揭示g.22329038T＞C位点可能是柯乐猪产活仔数的一个重要分子标记。
参与文献
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