朱照武;庄洋;向春林;赵娜;李珊;向玲芳;莫开菊
【摘 要】This article discussed the impact of PMP pre-column derivation on monosaccharide derivatives from extraction pH and extraction times.Moreover, the influence of mobile phase on the HPLC chromato-graphic peaks also have been studied from the ratio of mobile phase, the pH of buffer and the concentra-tion of buffer.The results indicated:Neutralized the derivation liquid with HCl to pH7.0 could avoid the loss of derivatives products to the utmost.Extracting three times by chloroform could remove almost PMP and avoid the loss of derivatives.Reducing the ratio of organic phase or the pH of buffer could improve the seperation of peaks;the asymmetry factor of peaks could be maintained in the optimum range by increas-ing the concentration of buffer.%从PMP萃取酸度、萃取次数探讨了柱前PMP衍生方法对单糖-PMP衍生物的影响,并从流动相比例、缓冲液pH值、缓冲盐浓度三个方面对单糖柱前衍生HPLC的分离效果进行了优化研究.结果表明:单糖进行PMP衍生后,用HCl中和至pH为7.0,能最大限度避免单糖-PMP衍生产物的损失;使用萃取PMP三次时,能在除去
PMP的情况下避免单糖-PMP衍生产物的损失;降低流动相中有机相的比例或提高缓冲液的pH值,有利于谱峰分离度的提高;提高缓冲盐浓度,有利于保持谱峰的对称性.
【期刊名称】《湖北民族学院学报（自然科学版）》
【年(卷),期】2015(033)003
【总页数】5页(P337-341)
【关键词】单糖;PMP衍生物;高效液相谱;分离度;不对称因子
【作 者】朱照武;庄洋;向春林;赵娜;李珊;向玲芳;莫开菊
【作者单位】湖北民族学院生物科学与技术学院,湖北恩施445000;生物资源保护与利用湖北省重点实验室(湖北民族学院) ,湖北恩施445000;湖北民族学院生物科学与技术学院,湖北恩施445000;生物资源保护与利用湖北省重点实验室(湖北民族学院) ,湖北恩施445000;湖北民族学院生物科学与技术学院,湖北恩施445000;生物资源保护与利用湖北省重点实验室(湖北民族学院) ,湖北恩施445000;生物资源保护与利用湖北省重点实验室(湖北民族学院) ,湖北恩施445
000;湖北民族学院生物科学与技术学院,湖北恩施445000;生物资源保护与利用湖北省重点实验室(湖北民族学院) ,湖北恩施445000;湖北民族学院生物科学与技术学院,湖北恩施445000;生物资源保护与利用湖北省重点实验室(湖北民族学院) ,湖北恩施445000;湖北民族学院生物科学与技术学院,湖北恩施445000;生物资源保护与利用湖北省重点实验室(湖北民族学院) ,湖北恩施445000
【正文语种】中 文
pmp报考条件【中图分类】O657.72
多糖类物质广泛存在于自然界中，近年来，我国对植物多糖展开了广泛的研究，植物多糖的药理活性是研究的重点［1－4］.多糖是由单糖通过糖苷键连接而成的，多糖的单糖组成作为一级结构的主要内容，自然成为研究多糖生物活性的基础［5］.糖类物质因不具有发基团不能直接使用紫外和荧光检测而限制了分析手段的应用，自1989年Honda等［6－8］首次在弱碱性条件下成功实现PMP糖类衍生，使糖类被标记上紫外吸收基团，具有强烈的紫外吸收，糖类的分析方法就得到快速发展.其中，PMP柱前衍生化HPLC分析成为糖类分析的重要方法.杨兴斌等［9］建立了当归多糖单糖组成的PMP柱前衍生化HPLC方法，Lv等［10］利
用PMP柱前衍生化HPLC法分析出绿茶多糖由甘露糖、木糖、阿拉伯糖等9种单糖组成.
尽管PMP在糖类检测方面具有优越性，但是糖类－PMP衍生方法仍存在一定不足.有报道指出，PMP衍生产物易丢失1分子PMP，且PMP试剂的疏水性偏低，多次萃取难以完全去除，萃取过程也会引起部分样品的损失［11］.Castells［12］也报道过PMP萃取过程会导致衍生产物的损失.此外，戴军［13］对萃取时溶液的酸度进行研究，发现溶液偏碱性时衍生产物在中有一定的溶解度，会造成损失，这与Strydom［14］的研究结果一致；若萃取时溶液偏酸性，衍生产物不稳定，也会造成结果偏低.
单糖种类繁多，许多植物多糖的单糖组成复杂，经常需要调整液相谱条件使各种单糖衍生物的谱峰达到完全分离.在谱柱固定的条件下，谱峰的分离效果很大程度取决于流动相，因此，了解流动相对谱峰分离效果及峰形的影响有利于在不同条件下获得良好的单糖衍生物谱图.
本文从单糖的PMP衍生方法及衍生产物的HPLC分离两个方面进行探讨，为单糖柱前PMP衍生HPLC方法的优化提供一定的理论依据.
1.1 材料与试剂
D－甘露糖、D－半乳糖、L－鼠李糖、L－阿拉伯糖 德国Dr.Ehrenstorfer公司；D－葡萄糖、L－岩藻糖 美国sigma公司；1－苯基－3－甲基－5－吡唑啉酮（PMP）、D－葡萄糖醛酸、D－半乳糖醛酸 国药集团化学试剂有限公司；甲醇、乙腈 谱纯 美国TEDIA天地试剂公司；磷酸氢二钾、磷酸二氢钾、氢氧化钠、盐酸、均为国产分析纯 国药集团化学试剂有限公司.
1.2 仪器与设备
P680 ALPG高效液相谱仪，包括DAD－100检测器、TCC－100柱温箱和Chromeleon谱工作站（戴安中国有限公司）；MS1 Minishaker漩涡混合器（德国IKA公司）；GZX－9140 MBE数显鼓风干燥箱（上海博迅实业有限公司医疗设备厂）；KQ5200B型超声波清洗器（昆山市超声仪器公司）.
1.3 方法
1.3.1 单糖的衍生 分别配制一定浓度的甘露糖、鼠李糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖及岩藻糖的单糖标准溶液和混合标准溶液.各标准溶液分别取50 μL置
于5 mL的具塞试管中，各加50 μL 0.6mol／L的NaOH溶液，漩涡混匀；再加100μL0.5mol／L的PMP甲醇溶液，漩涡混匀，在70℃的烘箱中避光反应100min，取出避光放置10min冷却至室温，加一定量的0.3 mol／L的HCL，加水至2 mL，再加2 mL的，漩涡混匀，静置，弃去相，如此萃取几次.将水相用0.45μm微孔膜过滤后供HPLC进行分析.
1.3.2 高效液相谱分析 谱条件：Agilent ZORBAX Eclipse XDB－C18谱柱（250mm×4.6mm，5μm）；流动相：A液：0.1mol／L的pH6.7磷酸钾盐缓冲液，B液：乙腈；柱温：30℃；检测波长：250 nm；流速：1 mL／min；进样体积：20μL.
1.3.3 萃取酸度对PMP衍生产物的影响 衍生反应结束后，待混合标准液冷却至室温，分别加入80、90、100、110、120μL 0.3mol／L的盐酸，加水至2mL，同1.3.1法萃取、过0.45μm微孔膜后进行HPLC分析.
1.3.4 萃取过程对PMP残留及衍生产物的影响 样品按1.3.1衍生中和后，加入，漩涡混匀10s间隔5s，重复3次后，静置，弃去层，如此分别萃取1、2、3、4、5次.样品过0.45μm微孔膜后进行HPLC分析.
1.3.5 流动相比例对单糖衍生物的分离度影响 混合标准单糖溶液进行PMP衍生后，分别在流动相比例为A液∶B液＝80∶20、81∶19、82∶18、83∶17的条件下进行HPLC分析，谱峰的分离度R．
1.3.6 流动相pH值对单糖衍生物的分离度影响 分别配制pH为6.5和6.7的0.1 mol／L的磷酸钾盐缓冲液为A液，以最佳流动相比例对单糖衍生物进行HPLC分析，谱峰的分离度R．
1.3.7 磷酸缓冲盐浓度对谱峰对称性的影响 分别配制浓度为0.01、0.05、0.1mol／L pH6.7的磷酸钾盐缓冲液作为流动相A液，在最佳流动相比例下，对葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖、岩藻糖四种单糖衍生物进行HPLC分析，谱峰的不对称因子As．
2.1 萃取酸度对PMP衍生产物的影响
PMP衍生结束后，加入HCl中和，在中性条件下，利用萃取出多余的PMP，保留单糖－PMP衍生产物.萃取时溶液环境偏酸或偏碱均会对单糖－PMP衍生产物造成影响，如表1，若溶液偏碱性，则单糖－PMP衍生物的峰面积低于完全中和时的测定结果，若中和过度，溶液偏酸性，单糖－PMP衍生物的峰面积也低于完全中和时的测定结果.总之，萃取时溶液偏酸或偏碱均会影响试验结果，这与戴军［13］的研究一致.
试验结果表明，萃取酸度对不同单糖衍生物的影响不同，对葡萄糖醛酸和半乳糖醛酸的PMP衍生产物的影响最大，对甘露糖和鼠李糖的PMP衍生物的影响最小.溶液呈中性时，八种单糖－PMP衍生物峰面积的总和最大.
2.2 萃取过程对PMP残留的影响萃取时，若PMP萃取不彻底，HPLC图谱中PMP峰明显，影响图谱效果；若PMP萃取过度，可能会造成单糖－PMP衍生产物的损失.分别对混合标准品的衍生液萃取1、2、3、4、5次后的结果如图
1和表2.
萃取一次时，溶液中单糖－PMP衍生产物的峰面积最大，但PMP残留严重，峰面积大于单糖－PMP衍生产物，当萃取次数达到3次时，PMP残留量较低，不影响图谱效果，萃取4次时图谱上已无明显PMP峰.
但随着萃取次数的增加，单糖－PMP衍生物的含量却逐步降低，萃取5次时，单糖－PMP衍生物的含量出现明显下降.因此，综合考虑单糖－PMP衍生物的保留、PMP的去除以及萃取工作量，选择萃取3次较合适.
2.3 流动相比例对单糖衍生物分离度的影响
在实验条件下，8种单糖衍生物的保留顺序依次为甘露糖、鼠李糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖、岩藻糖.四种流动相比例条件下，8种单糖衍生物的谱峰分离效果如图2.
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