·研究论文·
Chinese Journal of Animal Infectious Diseases
中国动物传染病学报摘 要：本研究根据GenBank 中已有的虾肝肠胞虫（EHP ）和虾血细胞虹彩病毒（SHIV ）基因的保守序列，设计特异的引物和探针。建立了快速诊断EHP 和SHIV 的双重TaqMan 实时荧光定量PCR 检测方法，并对其特异性、敏感性和稳定性进行检测。结果表明：该方法检测限可达10 copies/μL ，其敏感性是SYBR Green real-time PCR 的10倍，普通PCR 法的100倍；对白斑综合征病毒、传染性皮下及造血组织坏死病毒、高致病性副溶血弧菌，以及桃拉综合征病毒的检测结果均为阴性，表明无交叉反应，具有良好特异性；重复性试验结果表明，该方法Ct 值的变异系数小于4%，具有良好的稳定性。对37份已知检测结果的样品进行检测，结果符合率为100%。本研究建立的EHP 和SHIV 检测方法具有快速、特异性强、灵敏度高等优点，适用于对虾隐性感染的早期监测。
关键词：虾肝肠胞虫；虾血细胞虹彩病毒；TaqMan 荧光定量PCR 中图分类号： S852.723
文献标志码：A                                        文章编号：1674-6422（2022）01-0112-08
Development of a Duplex TaqMan Real-time PCR Assay for Detection of Enterocy
Tozoon Hepatopenaei and Shrimp Hemocyte Iridovirus
HOUYuee 1, ZENG Junxia 1, LAN Jianyuan 1, XU Zaozhu 1, LIAO Xiuyun 2, LUO Baozheng 2
(1. Zhuhai Kerric T esting T echnolongy Co. Ltd., Zhuhai 519000, China; 2. Gongbei Customs district technology center, Zhuhai 519015, China)
收稿日期：2019-09-04
基金项目：珠海市公共技术服务平台产学研协同创新计划项目（IETP201901011）作者简介：侯月娥，女，硕士，主要从事畜禽和水产疾病及免疫防治通信作者：罗宝正，E-mail：*************
EHP 、SHIV 双重TaqMan 实时荧光定量PCR
检测方法的构建及应用
侯月娥1，曾俊霞1，蓝间媛1，许枣珠1，廖秀云2，罗宝正2
（1.珠海科艺普检测科技有限公司，珠海51900；2.拱北海关技术中心，珠海519015）
2022,30(1): 112-119Abstract:  In this study, specific probes and primers were designed according to Enterocy Tozoon Hepatopenaei (EHP) and Shrimp Hemocyte Iridovirus (SHIV) gene sequences in G
enBank. A  d uplex TaqMan-based real-time quantitative PCR assay was then developed by optimizing the reaction conditions. The results demonstrated that this PCR assay was more sensitive for EHP and SHIV with the detection limit of 1×10 copies/μL, which was 10-fold higher than SYBR Green real-time PCR and 100-fold higher than conventional PCR. Specifi city tests showed no cross reactions with White spot syndrome virus, Infectious hypodermal and hematopoietic necrosis virus, High pathogenicity ibrio parahaemolyticus and Taura syndrome virus. Repeatability tests demonstrated that the threshold cycle of the method gave a good stability with the coeffi cient of variations were less than 4%. Then 37 samples were tested by using a duplex TaqMan real-time PCR and conventional PCR and the results reached 100% agreement. In conclusion, the duplex TaqMan-based real-time quantitative PCR assay developed here were specifi c and sensitive for rapid detection of EHP and SHIV . Therefore, it could be suitable for early duplex TaqMan-based real-time quantitative PCR assay of latent infection of shrimp.
Key words:  Enterocy tozoon hepatopenaei; shrimp hemocyte iridovirus; TaqMan real-time PCR; detection
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侯月娥等：EHP、SHIV 双重TaqMan 实时荧光定量PCR 检测方法的构建及应用第30卷第1期虾肝肠胞虫（Enterocytozoon hepatopenaei, EHP）是2009年于泰国养殖池塘生长迟缓的斑节对虾（Penaeus monodon）中发现的专门寄生于细胞内的原生生物[1-2]。主要感染凡纳滨对虾（Litopenaeus vannamei）、斑节对虾（Penaeusm onodon）等重要养殖虾类[3]，Flegel（2012）报道，EHP在泰国和越南出现白便综合征（white feces syndrome，WFS）的斑节对虾和凡纳滨对虾中有较高的检出率，且严重感染虾肝肠胞虫。对虾血细胞虹彩病毒最早于1993年在靠近厄瓜多尔的对虾养殖场中的原糙对虾（Protrachypene precipua burkenroad）中被发现的，病虾症状活力较差，肝胰腺明显萎缩，肌肉发白，肠道发红、断裂，空肠空胃，鳃、步足及游泳足发黑。2017年，我国第一次在南美白对虾上发现虾血细胞虹彩病毒，根据虾感染该病毒后的临床症状和病理症状，命名为虾血细胞虹彩病毒（Shrimp hemocyte iridovirus, SHIV）[4]。SHIV和EHP是我国对虾养殖过程中的两种新发疫病，前者导致对虾大量的死亡，后者导致对虾生长缓慢，参差不齐，甚至生长停滞，仅偶尔伴随有白便或者在应激条件下才出现大量死亡，所以养殖投入高但收获甚微，给养殖业造成巨大的经济损失。
目前，对虾病害种类较多，诊断手段主要包括病理学和生物学方法、免疫诊断法分子杂交[2,5-6]、电镜观察及PCR技术。已建立的常规PCR技术，灵敏性较高，多为一次检测一种病原，但是其耗时较长，需要进行琼脂糖凝胶电泳，容易对环境造成污染。而双重实时荧光定量PCR不仅可以同时检测两
种病原，并且耗时较少，病原核酸添加以后整个过程无需开盖操作，检测结果可以直接呈现在电脑或
检测仪器上，灵敏度为普通PCR的100倍，大大提高了检测结果的敏感性和准确性。更利于对病原的早期诊断，便于及时采取有效的防治措施。
1 材料和方法
1.1 试验材料  虾肝肠胞虫（E H P ）、S H I V 、白斑综合征病毒（White spot syndrome virus, W S S V ）、传染性皮下及造血组织坏死病毒（Infectious hypodermal and hematopoietic necrosis virus, IHHNV）、高致病性副溶血弧菌（Vibrio
parahaemolyticus , VP）以及桃拉综合征病毒（Tauras
syndrome virus, TSV）阳性样品均为本实验室采自珠海南美白对虾患有该病的样品，经PCR检测并测序后确认为阳性。
1.2 主要试剂  病毒DNA/RNA小量制备试剂盒购自广州吉瑞基因科技有限公司；AceQ qPCR Probe Master Mix购自Vazyme公司；琼脂糖凝胶DNA纯化回收试剂盒以及普通质粒小量提取试剂盒均购自Omega。1.3 双重荧光定量PCR 引物和探针的设计  通过对EHP和SHIV所有已知序列利用MegAlign进行同源性分析，确定其保守序列，然后根据EHP（GenBank 登录号：FJ496356.1）和SHIV（GenBank登录号：KY681040.1）的保守核酸序列，利用Primer Premier 5.0和Oligo7设计软件设计特异性引物和荧光探针（表1），引物探针由上海辉睿生物科技有限公司合成。
表1 本研究所用引物
Table 1 Primers used in this study
探针/引物名称
Primer 引物序列（5'-3'）
Sequence
片段长度Length SHIV-F gcaacaagcttccagcaa 114 bp SHIV-R ttcaaattcaacggggcaat
SHIV-Probe HEX-cctgattcgattccacgttgct EHP-F tcgaaagtgattagacaccg 92 bp EHP-R gatttctcccacaccaagacca报考条件
EHP-Probe FAM-tctagcagtaaactatgccgaca-BHQ1SHIV-fs CCCGAAGTTATCGCAGTAGAC 299 bp SHIV-rs TGCCCATCTAACACCATCTC SHIV-f CCGAAGTTATCGCAGTAG 102 bp SHIV-r TTCCACCAACGAATACAA EHP-fs CGGAAGGACACTACCAGGAG 254 bp EHP-rs CGGAACCTGTTATTGCCTTT EHP-f CTCGCAACACCCAGCAT 98 bp
EHP-r
GGGATCAAGGACGAAGGC
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1.4 总核酸的提取及模板的制备
1.4.1 组织样品的处理  先在2 mL匀浆管中加入约3粒钢珠，大钢珠1粒（直径4.5 mm），小钢珠2粒（直径
2.5 mm）；取发病虾组织（肝胰腺、腮、肠道、肌肉）约100 mg病料至管中，加入500 μL PBS；将匀浆管置于组织匀浆器中匀浆1 min，-40℃冻存至少30m i n，再放回常温溶解，反复冻融2～3次，每次冻融均置于组织匀浆器匀浆1次；
10 000×g离心5 min，取约200 μL上清液于1.5 mL离心管中，编号备用。
1.4.2 核酸提取  依据Mabio病毒DNA/RNA提取试剂盒的说明书操作，阳性对照也需要同时提取的核酸保存于-20℃备检。
1.5 标准品的制备  取1.4.2中提取的总核酸。分别进行SHIV和EHP目的基因扩增。扩增条件：94℃预变性3 min；94℃变性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸30 s，共40个循环；72℃延伸8 min。反应结束
后，取5 μL PCR反应产物进行琼脂糖凝胶电泳，扩增出SHIV（114 bp）和EHP（92 bp）目的基因。将获得的两种PCR产物琼脂糖凝胶电泳后，切胶回收纯化，分别克隆至pMD18-T载体中，转化到DH5α感受态细胞，筛选阳性克隆重组质粒，送上海辉睿生物科技有限公司测序鉴定。对于鉴定正确的重组质粒，分别命名为pMD-SHIV和pMD-EHP。对阳性质粒进行浓度测定，拷贝数计算，分装于-80℃保存备用。
1.6 实时荧光定量PCR扩增  以提取的SHIV和EHP的核酸DNA为模板，反应体系如下：AceQ qPCR Probe Master Mix 10 μL，将引物SHIV-F、SHIV-R、EHP-F、EHP-R和探针稀释至终浓度为0.1~0.6 μmol/mL，模板DNA为2 μL，无RNase的ddH2O补足20 μL。实时荧光定量PCR扩增程序：95℃预变性3 min；95℃变性10 s，55℃~65℃退火30 s，40个循环，按照不同体系，不同浓度配比，不同的退火温度进行实时荧光定量PCR反应条件优化，筛选出最好的体系、引物、探针浓度及退火温度
1.7 实时荧光定量PCR标准曲线的建立  将1.5制备的SHIV和EHP的DNA标准品做10倍系列稀释，用不同稀释梯度的RNA作为模板，每个梯度的DNA设立3个重复。使用优化的反应体系进行实时荧光定量PCR扩增。荧光定量PCR的反应条件：95℃预变性3 min，95℃变性10 s，退火温度根据1.6摸索出来的最适温度，40个循环，每个循环结束时进行荧光信号采集。
1.8 双重实时荧光定量PCR
1.8.1 敏感性试验  将测定好DNA浓度的模板进行10倍系列稀释，用本研究建立的双重实时荧光定量PCR测定其敏感性。
1.8.2 特异性试验  以提取的SHIV、EHP、IHHNV、WSSV核酸为模板，分别进行PCR扩增，验证其特异性。
1.8.3 稳定性试验  对已知浓度的质粒107 copies/μL进行10倍梯度稀释，用已构建的SHIV和EHP双重荧光定量方法进行批次间的重复试验。将上述的同一样品放置1个月，用相同条件对其进行批次间的重复试验。
1.8.4 样品检测试验  选取已知的SHIV和EHP阳性、阴性的样品共37份，用本研究建立的SHIV和EHP双重荧光定量PCR检测方法进行临床检测。
2结果
2.1 标准品的制备  重组质粒的PCR检测结果显示，SHIV和EHP的扩增产物的大小分别为114 bp和92 bp，与预期大小一致（图1、图2）。测序结果表明，克隆的虾肝肠胞虫目的基因序列、虾血细胞虹彩病毒目的基因序列分别与虾肝肠胞虫参考序列（GenBank登录号：FJ496356.1）、虾血细胞虹彩病毒参考序列（GenBank登录号：KY681040.1）的相似性达100%。证明目的基因被成功插入载体中。2.2
双重实时荧光定量PCR扩增通过对SHIV和EHP单项和双重实时荧光定量PCR的条件优化，SHIV-F/SHIV-R的终浓度为0.4 μmoL/mL，探针终浓度为0.2 μmol/mL，EHP-F/EHP-R的终浓度为0.35 μmoL/mL，探针终浓度为0.25 μmoL/mL，退火温度为60℃时，对同一标准品的检测信号值最强，Ct值最小。
2.3 双重实时荧光定量PCR标准曲线的建立  SHIV和EHP的荧光定量PCR反应标准品，其DNA混合液的
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侯月娥等：EHP、SHIV 双重TaqMan 实时荧光定量PCR 检测方法的构建及应用第30卷第1期梯度浓度从1×107 copies/μL～1×101 copies/μL的7个线性梯度的检测标准曲线呈等距性和平行性，具有较好的梯度性（图3）。
2.4 双重实时荧光定量PCR 特异性、敏感性以及稳定性
2.4.1 特异性试验  以SHIV、EHP、IHHNV、WSSV 的基因组为模板进行实时荧光定量PCR扩增，结果显示，仅有SHIV、EHP二者相应的荧光信号为阳性，其他病毒的检测均为阴性，说明此次构建的双重实时荧光定量PCR方法的特异性较强（图4）。
A                                                                                                                  B
图3 SHIV(A)和EHP(B)的real-time PCR 标准曲线Fig.3 Real-time PCR standard curve of SHIV(A) and EHP(B)
Log (Con.)
Log Starting quantity
36.7134.2031.68
29.1726.6624.1421.6319.1116.6014.08
0.0      1.0      2.0    3.0    4.0    5.0    6.0    7.0    8.0
C y c l e  n u m b e r (C t ）
Log (Con.)
Log Starting quantity
35.4732.8730.2727.6725.0722.4719.0717.2714.6712.07
0.0      1.0      2.0    3.0    4.0    5.0      6.0    7.0    8.0
C y c l e  n u m b e
r (C t )
斜率：-3.14264截距：39.22579
相关系数：-0.99929
扩增效率：1.08067斜率：-3.14264截距：39.22579
相关系数：-0.99929扩增效率：1.08067
图1 pMD-EHP PCR 鉴定结果Fig.1 PCR identifi cation of pMD-SHIV
M: DNA 相对分子质量标准（DL2000）; 1: SHIV; 2.阳性对照
M: DL2000 DNA marker; 1: SHIV; 2. Positive control
M          1          2
bp
700500
400300200100
图2 pMD-EHP PCR 鉴定结果Fig.2 PCR identifi cation of pMD-EHP
M: DNA 相对分子质量标准（DL2000）; 1: EHP; 2.阳性对照
M: DL2000 DNA marker; 1:EHP; 2. Positive control  M          1          2
bp
2.4.2 敏感性试验  将体外转录纯化后的SHIV和E H P 的D N A 标准品，用核酸蛋白检测仪测定其浓度，计算其拷贝数，然后10倍系列梯度稀释为1×107 copies/μL～1×101 copies/μL，利用本研究建立的SHIV和EHP双重实时荧光定量进行扩增，得到SHIVV和EHP探针法实时荧光定量PCR的动力学扩增曲线（图5），在Ct ＜40范围内可以检出的最低DNA量为10 copies/μL，因此建立的此方法敏感性可以达到10 copies/μL。与本实验室前期构建的检测SHIV和EHP普通PCR及SYBR Green real-time PCR法相比较，是SYBR green real-time PCR敏感性的10倍（图6、7）、普通PCR法敏感性的100倍（图8）
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2.4.3 稳定性试验  由实验室不同试验操作人员批内、批间的重复性试验结果显示，该方法的变异系数均小于4%（表2），具有良好的稳定性。2.4.4 样品检测试验  对37份已知临床病料样品进行检测结果显示，EHP和SHIV共同阳性2份，EHP拷贝数约为
3.1×103 copies/μL和5.6×104 copies/μL，
S H I V 的拷贝数约为4.1×104 c o p i e s /μL 和6.1×105copies/μL；单EHP阳性的11份，拷贝数为5.2×102 copies/μL~3.2×106 copies/μL；单SHIV阳性7 份，拷贝数为1.1×102 copies/μL ~ 4.4×106 copies/μL；其余样品为阴性，与已知样品结果的符合率为100%。
图 5 荧光定量 RT-PCR 体系的敏感性检测
Fig.5 Sensitivity test of the real-time PCR for SHIV and EHP
注: SHIV （a~g ）和 EHP （1~7）模板拷贝数依次为1×107、1×106、1×104、1×103、1×102 和1×10 copies/μL Note: SHIV (a to g) and EHP (1 to 7), and the number of copies were 1×107, 1×106, 1×105, 1×104, 1×103, 1×102 and 1×10 copies/μL
2387.662093.301798.931504.561210.20915.83621.47327.1032.73-261.63
R n R e l a t i v e  f l u o r e s c e n c e  u n t i s
Cycle number
1  3  5  7    9    11  13  15  17  19  21  23  25  27  29  31  33  35  37  39
图4 双重实时荧光PCR 体系的特异性检测
Fig.4 Specifi c test of the real-time PCR system for SHIV and EHP
2387.662093.301798.931504.561210.20915.83621.47327.1032.73
-261.63
R e l a t i v e  f l u o r e s c e n c e  u n t i s  (R n )
Cycle number
1  3  5  7    9    11  13  15  17  19  21  23  25  27  29  31  33  35  37  39