Ningxia Medical University
Thesis for Application of Master’s Degree
The effect of NF-κB、TNF-α、IL-6 mRNA expression in RAW264.7 macrophage by PPE37 protein of Mycobacterium tuberculosis Student’s Name: Zhang Ruiqin
supervisor: A.P. Xu Guangxian
Subject Category: Medical science
Specialty: Clinical Laboratory Diagnostics
Major: Clinical Microorganism and
Immunoregulation
College: Department of Medical Laboratory
Completion Date: Apr. 2013
基金来源
教育部“新世纪优秀人才支持计划”项目
项目编号：NCET11-11023
国家自然基金资助项目
项目编号：30960275
项目编号：31160494
中国博士后基金项目
项目编号：20110491554
宁夏医科大学“博士学位建设学科”开放课题项目编号：KF2010-4
宁夏医科大学学位论文独创性声明
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年月日年月日
宁夏医科大学关于学位论文使用授权的声明
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年月日年月日
IL-6 mRNA表达的影响
宁夏医科大学研究生院摘要
目的结核分枝杆菌全基因组测序完成后，研究者发现PE和PPE家族基因占结核
分枝杆菌编码区的10％，并且在致病分枝杆菌与非致病的分枝杆菌中存在差异表达。PPE家族中的PPE37蛋白同时位于结核分枝杆菌毒力有关的RD区。本论文研究PPE37
蛋白在结核分枝杆菌感染机体过程中发挥的免疫调节机制。
方法 1. 利用生物信息学软件（uniprot、protparam、GOR 4、SignaIP 4.1、Bcepred、NetMHC3.2 Server）分析PPE37蛋白的理化性质、二级结构及其B细胞/T细胞抗原表
位等结构特征，从而预测PPE37蛋白在结核分枝杆菌感染机体过程中发挥的免疫调控
机制。
2. 根据Gene Bank中登录的ppe37基因序列（序列号BX842578），设计（primer premier 5软件）并合成其引物。利用基因工程技术构建重组克隆载体pEasy E2-ppe37，经PCR、双酶切、基因测序证实
无误后，克隆至表达载体pET30a。重组表达载体pET30a-ppe37经IPTG诱导表达后，利用SDS-PAGE、Western blot分析其表达形式。
利用Ni-NTA琼脂糖柱对表达蛋白进行纯化，并通过AlpHaImager 2200 软件分析其纯
化率。
3. 建立重组PPE37蛋白（浓度为100ng/ mL、500ng/ mL、5000ng/ mL）刺激小鼠RAW26
4.7巨噬细胞模型，在24h、48h、72h分别收集细胞，提取总RNA，利用反转录
引物反转录为cDNA。建立1000ng/mLLPS刺激巨噬细胞模型作为阳性对照组。利用基
因工程技术构建细胞因子NF-κB、TNF-α、IL-6的标准质粒，并绘制标准曲线。利用Real-Time PCR检测上述各个组NF-κB、TNF-α、IL-6 mRNA的表达量。
结果 1. 生物信息软件分析证实PPE37蛋白结构稳定、亲水性强、无信号肽。在
线软件Bcepred显示PPE37蛋白的B细胞优势抗原表位区域为191-192；288-294；332-336；376-387。在线软件NetMHC3.2 Server显示PPE37蛋白的T细胞优势抗原表
位区域为0-9；144-153；156-165；239-248。这些结果证明PPE37蛋白在结核分枝杆菌感染机体过程中能被B细胞/T细胞识别，从而发挥免疫调控机制。
2. 经PCR、双酶切、基因测序证实成功构建重组表达载体pET30a-ppe37。将其转化到 E.coli BL21中，经IPTG诱导，重组蛋白以包涵体的形式大量表达。利用AlpHaImager 2200 软件分析经Ni-NTA琼脂糖柱纯化后的重组蛋白纯化率为96.2%。
3. 通过检测细胞因子NF-κB、TNF-α、IL-6 mRNA表达量的变化，来观察PPE37蛋白对小鼠RAW26
4.7巨噬细胞的免疫学效应。浓度分别为100ng/ mL、500ng/ mL、5000ng/ mL的重组蛋白刺激巨噬细胞，24h后Real-Time PCR检测结果显示与空白对照组相比NF-κB、TNF-αmRNA的表达没有影响（p>0.05），而IL-6 mRNA的表达上调（p<0.05）；48h后NF-κB、TNF-α、IL-6 mRNA的表达显著上调（p<0.05）；72h后NF-κB、TNF-α、IL-6 mRNA的表达显著上调（p<0.05）。1000ng/ml LPS刺激巨噬细胞，24h、48h、72h均能使NF-κB、TNF-α、IL-6 mRNA的表达显著上调（p<0.05）。这些差异表达证实ppe37蛋白能引起的巨噬细胞免疫应答反应。
结论在结核分枝杆菌感染机体的过程中PPE37蛋白能够被B细胞、T细胞识别，从而发挥相应的体液免疫、细胞免疫反应。与此同时PPE37蛋白也可以通过调控细胞因子NF-κB、TNF-α、IL-6的表达引起巨噬细胞免疫应答反应。总之，PPE37蛋白在结核分枝杆菌感染机体的过程中发挥重要的免疫学效应。
关键词结核分枝杆菌，PPE37蛋白，RAW264.7巨噬细胞
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