沈健;冯晨;沈香娣;唐佩;冯磊
【摘 要】Objective To build and identify verdigris pseudomonas biofilm model in vitro. Methods Verdigris pseudomonas were selected. By modified plate methods, stable verdigris pseudomonas biofilm model in vitro was built. The shapes of verdigris pseudomonas biofilm model in vitro and pelagic type verdigris pseudomonas were observed by sem, Fontana silver staining method, AB combined extracellular polysaccharide staining. Results By AB combined extracellular polysaccharide staining, cells were light red, extracellular glucose was deep red, and background was blue. By Fontana silver staining, cell was faint red, extracellular glucose was deep yellow, and background was orange yellow. By sem, bacterial biofilm was short sticky, bounding by viscous material, and there was melicera fibrous brin among becterials. Conclusion Building verdigris pseudomonas biofilm model in vitro was simple, and the results were reliable and repeatable. It provided experimental basis for further verdigris pseudomonas clinical therap
y.%目的 建立和鉴定铜绿假单胞菌体外生物膜.方法 采用改良平板法,用扫描电镜、Fontana镀银染法和刚果红-阿利新蓝(AB)染液联合胞外多糖染法观察体外生物膜型的铜绿假单胞菌和浮游型铜绿假单胞菌的形态,建立稳定、可靠的铜绿假单胞菌体外生物膜模型.结果 刚果红-阿利新蓝(AB)染液联合细菌胞外糖染法,细菌细胞呈淡红,胞外糖为深紫红,背景呈蓝；Fontana镀银染法细菌细胞呈绛红,胞外糖为深黄,背景呈桔黄；扫描电镜下生物膜细菌呈短杆状,周围被黏稠状物质紧紧包绕,菌体间以黏稠的纤维状黏液丝相连.结论 铜绿假单胞菌体外培养建立生物膜的方法简便易行,结果可靠,重复性好,为进一步开展铜绿假单胞菌临床的研究提供了实验手段.
【期刊名称】《医学研究杂志》
【年(卷),期】2013(042)001
【总页数】5页(P50-54)中级会计报名时间及考试时间
【关键词】铜绿假单胞菌;生物膜;建立;鉴定
【作 者】沈健;冯晨;沈香娣;唐佩;冯磊
【作者单位】310053杭州,浙江医学高等专科学校;310058 杭州,浙江大学医学院;310053杭州,浙江医学高等专科学校;325000 温州医学院;310058 杭州,浙江大学医学院;311300杭州,浙江农林大学健康管理系
【正文语种】中 文
细菌生物膜(bacterial biofilm，BBF)是指细菌吸附于惰性物体如医学材料或机体黏膜表面后，分泌多糖基质、纤维蛋白、脂蛋白等蛋白－多糖复合物，细菌相互粘连形成结构性落的膜样物［1］。细菌生物膜内的细菌具有传染性和致病性，是医院感染最主要原因，约占医院感染总病例的40%。约40%医院感染由吸附医学器械或材料表面的细菌生物膜引起，若医疗器械和材料严格消毒有困难或消毒不严，生物膜内细菌易在医生与病人、病人与病人之间引起交叉感染［2］。细菌能黏附几乎所有大多数医疗器械的材料表面并形成生物膜，其中以中心静脉导管、导尿管更为常见，用扫描电镜可清楚地观察到上述导管内、外表面上的细菌生物膜［3，4］。细菌生物膜对临床抗菌药物呈现高度耐药性，导致发生慢性难治性感染。铜绿假单胞菌(pseudomonas aeruginosa)是最易形成细菌生物膜的细菌之一［5］。铜绿假单胞菌不仅是临床化脓性感染标本中最常见的病原菌，且因形成生物膜
和高耐药性，导致其相关疾病的临床疗效较差，故该菌是近年日益受到重视。因此，建立稳定可靠的体外铜绿假单胞菌生物膜模型将有助于深入探讨铜绿假单胞菌生物膜形成机制，对进一步开展铜绿假单胞菌临床的研究提供了实验手段。2010安徽高考英语答案
材料与方法
1.材料:(1)菌株来源:铜绿假单胞菌分离菌株由浙江大学附属第一医院细菌室提供，标本取自住院病人导尿管内附着物。(2)培养基配制［6］:胰酶大豆培养基、MH肉汤依据文献配制。大豆胰酶肉汤 (TSB，法国 BioMerie公司);Muller2Hinton肉汤 (MHB，美国DIFCO公司)。(3)试剂:硝酸银、2.5%戊二醛、0.1mol/L PBS、丙酮、乙酸异戊酯无水氯化钙、鞣酸、石碳酸、冰醋酸、硫代硫酸钠等化学试剂均为国产分析纯，1%锇酸 (Fisher公司)，阿利新蓝、刚果红 (Fisher公司)。(4)主要仪器:扫描电镜(Stereoscan 260，Leica Cambridge Ltd)、临界点干燥器(HCP－2，HITACHI)、离子溅射仪(E－1020，HITACHI)、比浊仪 (法国 BioMerieux公司)、定量 PCR仪(ABI7700)。(5)载体:微孔滤膜。医用硅胶膜片 (60mm×60mm，厚115mm)。(6)多媒体彩病理图文分析软件(MPIAS2500)。
2.方法:(1)铜绿假单胞菌分离和鉴定:将采集的标本作常规涂片分离培养，生化反应鉴定菌种，
菌种鉴定依据按文献［5］。原始标本片结晶紫染初步鉴定:将标本涂片用结晶紫染液染3min，然后油镜观察。(2)铜绿假单胞菌生物膜模型的建立及分组:①建立铜绿假单胞菌生物膜培养用改良平板法［7，8］:将新鲜培养的铜绿假单胞菌用胰酶大豆肉汤配制成1.5×108 CFU浓度菌液 ，吸入200μl加入24孔平板中，分成两组，一组浮游培养(培养液中未加硅胶片)，另一组生物膜培养(培养液中加硅胶片)，37℃培养，每48h更换1次培养基，培养基为MH肉汤，连续培养7天后，即可形成稳定的生物膜;②分组:分3组，分别为浮游液对照培养组，放置生物膜培养后的培养液组和生物膜培养硅胶片黏附组。取浮游培养(培养液)、生物膜培养(培养液)以及生物膜培养(硅胶片黏附)铜绿假单胞菌进行银染(×1000)、胞外糖染(×1000)并且扫描电镜(×1000)鉴定。(3)铜绿假单胞菌生物膜的鉴定:①生物膜胞外多糖染鉴定［9］:滴生理盐水少许于洁净载玻片上，用接种针挑取细菌与之混匀后，再滴加与生理盐水等量的AB染液，混匀，静置3～5min，火焰加热固定，直到染液挥发完全，然后滴加少许刚果红染液，均匀涂布，火焰加热干燥后，用蒸馏水冲洗至没有染料流下为止，水吸干后用油镜观察;②生物膜快速银染鉴定［10，11］:将标本涂于洁净的玻片上做成薄皮，于空气种自然干燥;用固定液固定1～2min;用蒸馏水洗;加鞣酸酶染液轻微加热至有蒸汽出现(约2min);用蒸馏水洗;加Fontana硝酸银溶液，轻微加热至有蒸汽出现(约2min);
冲洗，待干，镜检;③生物膜扫描电镜鉴定［12］:将不同组的标本加入2.5%戊二醛固定后送电镜室扫描电镜制样、观察。采用Costerton的方法，用扫描电镜观察体外生物膜型的铜绿假单胞菌和浮游型铜绿假单胞菌的形态。
许昌市人力资源和社会保障局结 果
1.刚果红－阿利新蓝染法结果:刚果红－阿利新蓝(AB)染液联合对浮游培养(培养液)、生物膜培养(培养液)和生物膜培养(硅胶片黏附)铜绿假单胞菌胞外糖染(×1000)，细菌细胞呈淡红、边缘清晰，围绕菌体一圈为胞外糖呈深紫红，其中生物膜培养(硅胶片黏附)细菌细胞与细胞之间紧密堆积比浮游培养(培养液)铜绿假单胞菌胞外糖染和生物膜培养(培养液)铜绿假单胞菌胞外糖染更密集，细胞之间边缘不清晰，深紫红胞外糖融合成团围绕菌体周围呈条状、束状、树枝状，背景均呈蓝(图1)。
图1 铜绿假单胞菌胞外糖染(×1000)A.浮游培养(培养液);B.生物膜培养(培养液);C.生物膜培养(硅胶片黏附)
2.银染法结果:Fontana镀银染法细菌呈绛红，胞外糖为深黄，其中生物膜培养(硅
嘉兴考试培训网胶片黏附)铜绿假单胞菌银染(×1000)，细菌间紧密堆积，与浮游培养和生物膜培养后培养液中铜绿假单胞菌银染比较明显密集，细菌呈绛红、细胞之间边缘不清晰，深黄胞外糖融合成片、成簇、成团围绕菌体周围呈条状，束状，树枝状，背景均呈桔黄(图2)。
图2 铜绿假单胞菌银染(×1000)A.浮游培养(培养液);B.生物膜培养(培养液);C.生物膜培养(硅胶片黏附)
3.扫描电镜结果:从扫描电镜的图片上可以看到铜绿假单胞菌生物膜在微孔滤膜上形成，生物膜细菌呈短杆状，其中生物膜培养(硅胶片黏附)铜绿假单胞菌银染(×1000)，细菌间紧密堆积，与浮游培养和生物膜培养后培养液中铜绿假单胞菌相比堆积更加密集，融合成片、成簇、成团围绕菌体，周围被黏稠状物质紧紧包绕，菌体间以黏稠的纤维状黏液丝相连(图3)。
讨 论
图3 铜绿假单胞菌扫描电镜(×1000)A.浮游培养(培养液);B.生物膜培养(培养液);C.生物膜培养(硅胶片黏附)
如何查询往届高考成绩单本试验采用用改良平板法［8，9］将隔夜新鲜培养的铜绿假单胞菌用胰酶大豆肉汤配制成1.5×108 CFU浓度菌液，在菌液量、灭菌滤膜及时间相同的情况下，不同量的培养基(MH肉汤)分别为1、2、3ml，经过5次重复观察，每次加入不同量的肉汤量的标本均能形成稳定的生物膜。细胞之间还存在着称为胞外糖的黏性物质。细菌胞外糖也称glycocalyx，是Costerton等［12］在20世纪70年代研究细菌体结构时用电镜确定下来的。研究人员明确提出细菌胞外糖与细菌致病性有关，认为胞外糖还可以帮助细菌体向周围获得足够营养［13］。营养越丰富，胞外糖产生及作用越强，更快形成稳定的生物膜。关于胞外糖在医学微生物学中的作用较多:胞外糖促使细菌集抵抗吞噬，保护细菌不与抗体结合，形成集内细菌交替性生长(隐性生长)［14］。这方面的基础工作已较多，类似胞外多糖生物学活性的研究中，蓝细菌的胞外多糖特具有特有生物学活性，有抗辐射、抗氧化、抗衰老、以及潜在的抗肿瘤、抗病毒等作用［15］。从肠球菌的发酵液中提取的胞外多糖能增强免疫力低下的荷瘤小鼠的免疫功能，但是对胞外糖的研究成果一直未在临床广泛应用。
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