田卓;曹际娟;崔妍;赵良娟;李宗梦
【摘 要】Objective] In order to improve the efficiency of detecting ingredients of animal origin, the PCR-nucleic acid strip rapid detection technology system was established.[ Method] In view of the species specific DNA sequences, primers were designed and marked;the PCR re-action system was established and optimized; the results were interpretated by the nucleic acid strip.[ Result] The results showed that: the PCR-nucleic acid strip is high specificity;absolute sensitivity is 0.001 3 ng/μL;the actual sensitivity in mixed samples is 0.01%;the actual sensitivity in processing sample is 0.1%;the detection rate of minimum detection limit is 100%, the stability is good.[Conclusion] To sum up, the high sensitivity as PCR and high specfticity as immunology made the PCR-chromatography strip valuable for the rapid detection method.%[目的]提高动物源性成分检测效率，建立PCR－核酸试纸条快速检测技术体系。[方法]针对物种特异性DNA序列，设计并标记引物；建立并优化PCR反应体系；利用通用核酸试纸条进行结果判读。[结果]试验表明，PCR－核酸试
纸条特异性高；绝对灵敏度为0．0013 ng／μL，混合样品，实际灵敏度为0．01％；加工处理样品，实际灵敏度为0．1％；最低检测限检出率为100％，稳定性良好。[结论]综上，PCR－核酸试纸条方法是一种既有PCR反应的高灵敏度，又具有免疫学检测的特异性好的特点，同时操作简便的快速检测方法。
【期刊名称】《安徽农业科学》
【年(卷),期】2016(044)020
【总页数】4页(P83-85,117)
个人社保缴费查询【关键词】核酸试纸条;动物源;食品安全辽宁出入境检验检疫局
【作 者】田卓;曹际娟;崔妍;赵良娟;李宗梦
【作者单位】大连工业大学食品学院，辽宁大连116034; 大连出入境检验检疫局，辽宁大连116400;大连工业大学食品学院，辽宁大连116034; 辽宁出入境检验检疫局，辽宁大连116001;大连出入境检验检疫局，辽宁大连116400;天津出入境检验检疫局，天津300201;天津出入境检验检疫局，天津300201
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【正文语种】中 文
【中图分类】TS207
近年来，我国食品市场上一些不法分子为牟取暴利，在肉制品中搀杂使假、以假乱真。如2013年初，欧洲的“马肉风波”愈演愈烈，使得消费者“闻马变”；近日欧美的“鱼肉风波”又再一次拉响了食品安全的警钟。动物源性食品及饲料的安全隐患直接关系到人类的安危，引起了各国政府和消费者对食品及饲料的安全性高度关注。因此，迫切需要建立食品及饲料中动物源性成分快速、准确、简便的检测鉴定方法，对食品及饲料中动物源性成分检测鉴定，有利于保护消费者健康，维护消费者利益，防止疫情疫病的传入传出，并避免假冒伪劣食品的出现。
在动物源性成分检测方法中，基于核酸的分子生物学技术应用最为广泛，其中包括DNA测序、物种特异性PCR、实时定量PCR、RFLP等。PCR(聚合酶连反应)技术最早由Mullis等于1986年提出[1]，因其特异性强、敏感度高、操作简便等优点，目前已被广泛用于各种动物源性成分[2-6]和其他过敏原及细菌[7-8]的快速检测。但同时PCR技术有一定的局限性，技术含量高，电泳检测耗时、程序复杂、EB染时对环境有危害、依赖于昂贵的设备等。
因此，要在大量的日常检测和快速筛查工作中构建食品安全保障体系，就需要开发一些不依赖贵重仪器设备的、快速准确的现场检测试剂和简单、方便、经济的检测技术。
胶体金免疫层析法是一种快速的免疫学测定方法[9]，具有简便、快速、准确等优点[10]，在甲型H1N1病毒[11-12]、外源基因EPSPS[13]的检测等方面也有应用，在动物源性食品检测中的应用主要在于质量控制[14]、病原微生物检测[15]领域等。PCR-核酸试纸条则是利用PCR与通用免疫金标层析试纸条相结合的方法重新设计、标记引物，优化反应体系，以通用免疫金标层析试纸条为载体进行结果判读。笔者以鸽子肉为试验材料，建立一种PCR-核酸试纸条快速检测方法，充分利用PCR检测的高灵敏度、特异性强的特点，又结合了免疫金标试纸条简便、快捷、成本低的优势，实现对PCR结合试纸条检测，使检测结果可视化，直观简便，易于操作，对加工动物源性食品的质量进行把关，有利于维护消费者利益，保障人民生命安全，为打击违法行为提供技术支撑。
银行公共基础知识复习资料1.1 材料 市场购买鸽子肉1 kg，鸡、鸭、猪肉各1 kg，牛肉5 kg，采集肌肉组织。天根动物组织基因组DNA提取试剂盒；TaKaRa Ex Taq Hs DNA聚合酶(5 U/μL)；TaKaRa dNTP Mixture(2.5 mmol/L)；10X Ex Taq Buffer TaKaRa；Agilent DNA Chips(5067-1504)
、Agilent DNA 1000 Markers、Agilent DNA 1000 Ladder，安捷伦科技(中国)有限公司；PCR-核酸试纸条及展开液，天津出入境检验检疫局。
1.2 方法
1.2.1 检测原理。该研究标准采用PCR结合通用免疫金标层析试纸条的方法：根据物种特异性基因设计特异性引物，一条引物的5′端标记异硫氰酸荧光素(FITC)，另一条引物的5′端标记生物素(biotin)。PCR扩增产物经过试纸条检测，试纸条质控线变红，且检测线变红，PCR扩增产物为阳性；试纸条质控线变红，检测线不变，PCR扩增产物为阴性。PCR阳性产物经测序进行确证。
河南省公务员网络学院1.2.2 DNA提取。采用天根动物组织基因组DNA提取试剂盒进行提取。
1.2.3 引物设计。经反复检测验证，确定鸽子源性成分检测靶序列及特异性引物如下：CAATCCAAACCCATGATTCTTCCAGGAGTAATCCTACTGCTCACTCTTATAGCAACTGCCT-TCGTAGGTTATGTCCTGCCATGAGGACAAATATCGTTCTGA-GGAGCTACCGTAATTACCAACTTATTTTCAGCCCTCCCATAC-ATCGGACAGACCCTG
GTAGAATGAGCCTGAGGAGGATTCTC-AGTGGATAACCCAACCCTAACCCGATTCTTCGCCATTCACTT-CCTACTACCCTTTTTAATCGCAGGAATCACCC。引物为：①dove-C-F。5′-CAATCCAAACCCATGATTCTTC-3′，5′端标记异硫氰酸荧光素(FITC)。②dove-C-R。5′-GAGTAGTGCAGGGAATAGTATTGAG-3′，5′端标记生物素(biotin)。③扩增片段。扩增鸽子线粒体基因组CYTB区域一段长度为252 bps的DNA片段。
1.2.4 PCR扩增体系的优化。 对PCR-核酸试纸条反应体系进行优化，确定反应体系为：DNA模板1.0 μL，上、下游引物各0.8 μL，dNTP 2.0 μL，10X PCR buffer 2.0 μL，HS Taq DNA polymerase 0.2 μL，ddH2O 13.2 μL，总体积为20 μL。反应条件为：94 ℃ 预变性5 min；94 ℃ 变性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，30个循环后进入72 ℃、5 min。
1.2.5 PCR-核酸试纸条反应。取5 μL PCR产物点于核酸试纸条样品垫，用200 μL移液器吸取展开液，滴4～5滴进行检测，5 min后观察结果，在空白对照试纸条质控线变红，检测线不变；阳性对照试纸条质控线变红，检测线变红的条件下：试纸条质控线变红，且检测线变红，PCR扩增产物为阳性，初筛结果检出鹧鸪成分；试纸条质控线变红，检测线不变，PCR扩增产物为阴性，未检出鹧鸪成分。同时进行凝胶电泳检测。
2.1 引物特异性试验 以上述PCR-核酸试纸条反应体系及程序进行特异性检测，分别以取自鸽子的鸽子肉为阳性对照品，选择动物样品牛、羊、马、猪、鼠、兔、狗、猫、鸡、鸭、鹅及植物样品胡萝卜、洋葱等的基因组DNA为阴性对照，以无菌水为空白对照。结果显示，特异性较好，能对鸽子成分样品进行有效扩增，电泳及试纸条结果见图1。
2.2 灵敏度检测
2.2.1 PCR-核酸试纸条方法的绝对灵敏度试验。将鸽子基因组DNA 5倍倍比稀释，使其浓度为100、20、4、0.8、0.16、0.032、0.006 4、0.001 3、0.000 3、0.000 1、0.000 02 ng/μL。结果显示，电泳方法在浓度为0.16 ng/μL时有明亮条带，在浓度0.032 ng/μL时条带不清晰。PCR-核酸试纸条在浓度为0.001 3 ng/μL时检测线显示红，为阳性，在浓度为0.000 3 ng/μL时检测线不显，为阴性。结果表明，在绝对灵敏度方面，PCR-层析试纸条方法具有较高的灵敏度，比电泳方法高100倍。电泳及试纸条结果见图2。
2.2.2 鸽子肉和鸽子肉DNA实际灵敏度检测。为了验证该方法对鸽子肉及鸽子肉DNA检测的实际灵敏度，对混合DNA样品和混合肉样品分别进行了检测。以鸽子肉为阳性样品，以牛肉模拟掺假样品，将鸽子肉与牛肉切片，60 ℃烘干，研磨成粉末，过18目筛筛取粉末，
制备鸽子肉-牛肉的混合模拟样品，以鸽子肉肉粉的质量百分比(W/W)为100%、50%、25%、10%、5%、1%、0.1%、0.01%、0.001%比例混匀，提取基因组DNA，DNA浓度调至5 ng/μL。
研究生准考证打印时间将浓度均为5 ng/μL的鸽子肉DNA与牛肉DNA混合，使混合物中鸽子肉DNA含量依次为100%、50%、25%、10%、5%、1%、0.1%、0.01%、0.001%。对模拟样品进行灵敏度检测，试验所用样品均设置了3次重复。PCR-试纸条检测结果表明，当鸽子肉在混合肉品中的比例为100%、50%、25%、10%、5%、1%、0.1%、0.01%时，试纸条质控线和检测线均能显示红条带，最低检测限均可达0.01%。电泳及试纸条结果见图3。
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